肖向禹，吳熠丹，符雪瀅，孔翠瀅，王衡，周沛，張桂紅*（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國(guó)家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室，非洲豬瘟防控技術(shù)研究中心，廣東廣州510642）
 

       非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的急性、烈性和高度接觸的傳染性疾?。?］。2007年以前，ASF在撒哈拉以南國(guó)家流行，隨后一株高度毒力的ASFV被帶到高加索地區(qū)，開(kāi)始在東歐和俄羅斯傳播［2］。2018 年8 月，ASF 在中國(guó)的東北部暴發(fā)，隨后席卷全國(guó)，對(duì)經(jīng)濟(jì)社會(huì)產(chǎn)生巨大影響［3］。ASF被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織設(shè)定為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，而且屬于我國(guó)重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫情。ASFV是非洲豬瘟相關(guān)病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）的成員，也是的蟲(chóng)媒DNA病毒，其基因組為雙鏈DNA，大小為170 kb～190 kb之間，病毒粒子的外形近似六邊形，直徑約200 nm［4］。軟蜱是ASFV的重要傳播媒介，很早在非洲東部和南部的發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有攜帶ASFV的軟蜱，由于叮咬攜帶ASFV的病豬，也會(huì)成為ASFV潛在的傳染源，再次叮咬陰性疣豬時(shí)，使其感染ASFV。ASFV在野生豬群中通過(guò)蜱作為中間宿主在豬群傳播［5］。同時(shí)ASFV也可以通過(guò)空氣或附著在ASFV污染物的表面進(jìn)行傳播［6］。ASFV可以引起家豬和野豬特征性出血和發(fā)熱，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、皮膚發(fā)紺和多臟器廣泛性出血，強(qiáng)毒株感染時(shí)死亡率高達(dá)100%。由于ASFV的對(duì)機(jī)體免疫機(jī)制的影響極為復(fù)雜，基因型多，因此沒(méi)有有效疫苗用于防控［7］。ASFV 作為很具破壞性的病毒之一，對(duì)動(dòng)物健康、國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民生活構(gòu)成巨大威脅。
 

       目前我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)針對(duì)ASFV采取的措施主要是以預(yù)防為主，在豬場(chǎng)原材料和人工等方面嚴(yán)格把控，一切原材料進(jìn)入豬場(chǎng)之前進(jìn)行嚴(yán)格的殺菌和消毒，以控制ASFV 的傳入。消毒劑作為殺滅ASFV常用的主要消毒產(chǎn)品在豬場(chǎng)被廣泛使用。而臭氧作為消毒劑具備以下幾個(gè)特點(diǎn)。首先，臭氧是一種廣譜殺菌劑，可殺滅細(xì)菌繁殖體和芽孢、病毒、真菌等，且臭氧在水中殺菌速度是液氯的3000倍以上。其次，臭氧殺菌速度是急速的，當(dāng)濃度超過(guò)一定閾值后，消毒殺菌甚至可以瞬間完成。并且臭氧利用其強(qiáng)氧化性能消毒，不產(chǎn)生有害生成物，剩余臭氧會(huì)自行分解為氧氣，因而不產(chǎn)生殘余污染［9］。臭氧氣體和臭氧水消毒為臭氧常見(jiàn)的消毒方式，應(yīng)用控制簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)。由于臭氧特有的優(yōu)勢(shì)，其在食品處理中有很多附加價(jià)值，如無(wú)須使用化學(xué)藥劑，沒(méi)有化學(xué)副產(chǎn)物，減少成本支出，使用環(huán)境更安全?；诔粞醯倪@些特點(diǎn)，食品行業(yè)采用高濃度臭氧水進(jìn)行食品殺菌，主要應(yīng)用于員工洗手消毒、食品行業(yè)器械消毒、大小型蔬果處理廠、食品加工業(yè)和定點(diǎn)清潔。因此，為了探究將臭氧消毒應(yīng)用于豬場(chǎng)內(nèi)食品的消毒是否切實(shí)可行，本試驗(yàn)?zāi)M了豬場(chǎng)內(nèi)員工食材消毒場(chǎng)景，初步探究了不同濃度的臭氧水對(duì)ASFV殺滅效果。

1 材料和方法

1.1 材料

ASFV病毒粒子、豬紅細(xì)胞、PAMs細(xì)胞、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、1640培養(yǎng)基、胎牛血清、臭氧水機(jī)：“瑞凈活氧水機(jī)”（DT‐01C、12W）、“杭州陸恒生物”臭氧水濃度檢測(cè)儀M900。

1.2 方法

1.2.1 臭氧水機(jī)不同作用時(shí)間下臭氧水濃度變化啟動(dòng)臭氧水機(jī)，將水槽內(nèi)注滿自來(lái)水，在不同作用時(shí)間后，使用臭氧水濃度檢測(cè)儀測(cè)定臭氧水濃度，探究臭氧水隨時(shí)間變化曲線。

1.2.2 探究震蕩對(duì)臭氧水濃度的影響將3.0 ppm 臭氧水取出裝至50 mL 離心管內(nèi)，漩渦震蕩15 s，使用臭氧水濃度檢測(cè)儀測(cè)定臭氧水濃度，探究臭氧水濃度隨著震蕩時(shí)間變化曲線，探究震蕩是否能夠消除水中溶解的臭氧。

1.2.3 臭氧水殺滅ASFV效果探究

探究不同臭氧水對(duì)ASFV殺滅效果的試驗(yàn)分為三組：試驗(yàn)組，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。試驗(yàn)組：2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水10 mL與病毒懸液（病毒拷貝數(shù)為3.0×104）分別作用2 min、5 min和10 min。病毒陽(yáng)性對(duì)照組：無(wú)菌水10 mL與100 μL的病毒懸液（病毒拷貝數(shù)為3.0×104）分別作用2 min、5 min和10 min。作用結(jié)束后，震蕩去除水中溶解的臭氧，再接種于提前鋪有PAMs細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孵育2 h后，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。病毒陰性對(duì)照組：無(wú)菌水10 mL 震蕩，再接種于提前鋪有PAMs細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置8 個(gè)重復(fù)，孵育2 h 后，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別向上述三組不同處理實(shí)驗(yàn)組中加入豬紅細(xì)胞，觀察是否存在紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。以上涉及ASFV活病毒的試驗(yàn)均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臭氧水機(jī)不同作用時(shí)間下水中臭氧濃度變化臭氧水機(jī)不同作用時(shí)間下水中臭氧濃度變化（方差S2為1.0506）如圖1所示，隨著臭氧水機(jī)的開(kāi)啟，水中臭氧濃度逐漸上升，并于45 min 時(shí)到達(dá)5.2 ppm，45 min后，在臭氧水機(jī)開(kāi)啟的情況下水中臭氧濃度一直保持在5.0 ppm以上。

2.2 震蕩對(duì)臭氧水濃度的影響

震蕩對(duì)臭氧水濃度的影響（方差S2為1.02164）如圖2所示，隨著漩渦震蕩時(shí)間的增加，臭氧水的濃度逐漸降低，并于75 s接近0 ppm，表明震蕩可有效去除水中溶解的臭氧，可用于中止臭氧反應(yīng)試驗(yàn)。

2.3 臭氧水殺滅ASFV 效果探究

臭氧水殺滅ASFV的結(jié)果如表1所示：陰性對(duì)照（空白對(duì)照組）HAD結(jié)果為陰性，表明試驗(yàn)過(guò)程操作嚴(yán)謹(jǐn)，試驗(yàn)無(wú)污染。陽(yáng)性對(duì)照（病毒組）與無(wú)菌水作用2 min、5 min和10 min時(shí)，HAD結(jié)果均為陽(yáng)性，表明病毒活性良好，試驗(yàn)切實(shí)可行。臭氧水試驗(yàn)組，10 mL濃度為2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水與100 μL 3.0×104 拷貝數(shù)的ASFV 作用2 min、5 min和10 min時(shí)，HAD結(jié)果均為陰性，表明2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水與均100 μL3.0×104 拷貝數(shù)的ASFV作用2 min、5 min和10 min時(shí)，均可完全殺滅病毒。

3 討論

2018年8月，ASFV入侵我國(guó)，隨后政府立即發(fā)布了相關(guān)防控政策，但ASF仍在一年內(nèi)迅速蔓延至中國(guó)大陸各省。到目前為止，ASF疫情在我國(guó)尚未得到完全的控制。ASFV 在豬群中的持續(xù)感染，大量的豬只被撲殺，引起了豬群數(shù)量和生豬產(chǎn)量的劇烈波動(dòng)，導(dǎo)致豬肉價(jià)格的劇烈波動(dòng)，對(duì)我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了挑戰(zhàn)。ASF在我國(guó)的出現(xiàn)和迅速蔓延，表明我國(guó)針對(duì)外來(lái)動(dòng)物疾病的生物安全體系存在薄弱環(huán)節(jié)，因此我們需要提高生物安全意識(shí)，完善豬場(chǎng)生物安全體系［8］。目前我國(guó)豬場(chǎng)生物安全防控的措施主要從三方面入手：第一，建立良好的生物安全屏障；第二，建立良好的消毒和無(wú)害化處理措施；第三，提高豬場(chǎng)工作人員

的生物安全意識(shí)。良好的消毒措施對(duì)于控制ASFV的傳播至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)主要采取消毒劑的方式對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行消毒，主要以強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑、季銨鹽和鹵素類消毒劑為主，雖然對(duì)病原體有較好的殺滅效果，但大部分消毒劑對(duì)豬和人有一定危害，且對(duì)豬場(chǎng)內(nèi)員工食材并非是較好的消毒方法［10］。臭氧作為消毒劑具有高效性、廣譜性、無(wú)污染等特點(diǎn)。考慮到臭氧消毒的優(yōu)越性，本試驗(yàn)?zāi)M了豬場(chǎng)內(nèi)員工食材消毒場(chǎng)景，證實(shí)了臭氧水對(duì)ASFV有較好的殺滅效果?？梢?jiàn)，將臭氧水應(yīng)用于豬場(chǎng)內(nèi)員工食材的清洗和消毒是一種較優(yōu)的補(bǔ)充生物安全措施的方式。

4 結(jié)論

試驗(yàn)表明，臭氧水在不同作用時(shí)間下對(duì)ASFV具有較好的殺滅效果，可考慮將臭氧水應(yīng)用于豬場(chǎng)內(nèi)員工食材的清洗和消毒。

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